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Gebrauchsinformation

Neospora-p38 ELISA Cattle Test zum Nachweis von IgG-Antikörpern gegen den Erreger Neospora caninum bei Rindern

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PRODUKTBESCHREIBUNG UND ALLGEMEINE INFORMATIONEN

Der Neospora-p38-ELISA Cattle ist ein In-vitro Diagnostikum zum Nachweis von IgG-Antikörpern gegen den zu den Protozoen gehörenden Parasiten Neospora caninum. Das Produkt zeichnet sich gegenüber herkömmlichen ELISA-Tests zum Nachweis von Anti-Neospora Antikörpern durch die außergewöhnlich hohe Spezifität aus. Diese ist begründet durch die Verwendung eines hoch gereinigten Proteins, das nach seinem Molekulargewicht mit p38 bezeichnet wird (Schares et al. 2000).

Seit 1988 wird Neospora caninum als eigene Spezies beschrieben. Die protozoären Parasiten entwickeln sich in Rindern zu asexuellen, teilungsaktiven Stadien und Gewebezysten. Zielorgan ist vor allem das neuromuskuläre System. Bei Rindern gilt die Neospora caninum Infektion als Ursache für Verluste, vor allem durch Aborte, Totgeburten und lebensschwache Kälber (Conraths & Schares, 1999). In den USA ist der Erreger während der 90er Jahre als eine Hauptursache für Aborte und Totgeburten bei Rindern erkannt worden. In Europa wird Neospora caninum häufig in abortierten Rinderföten nachgewiesen (Wouda et al. 1997, Sager et al. 2001, Söndgen et al. 2001). Epidemiologische Studien lassen darauf schließen, dass 11,9% bis 12,5 % der Rinderaborte mit Neospora caninum Infektionen in Verbindung stehen (De Meerschman et al. 2000; Davison et al. 1999).


BESCHREIBUNG DES TESTPRINZIPS

Das Testsystem dient zur quantitativen Bestimmung von IgG-Antikörpern gegen Neospora caninum in Serumproben von Rindern. Die ELISA-Mikrotiterplatte wurde mit dem Neospora-spezifischen Protein p38 beschichtet. Antikörper gegen Neospora caninum bilden während der Inkubation der Serumprobe in der beschichteten Vertiefung einen Komplex mit dem Antigen. Nichtgebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Das hinzugefügte Enzym-Konjugat bindet sich an die antigengebundenen IgG-Antikörper. Ungebundenes Enzym-Konjugat wird herausgewaschen. Nach Hinzugabe der Substratlösung erfolgt eine Farbentwicklung durch antikörpergebundenes Enzym. Die Farbreaktion steht in direkter Korrelation zur Menge von Antikörpern in der Probe. Die diagnostische Bewertung erfolgt durch den Vergleich der Extinktionswerte von Proben und Kontrollen.


INHALT DES TESTKITS

  • Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, beschichtet mit dem Oberflächenprotein p38 von Neospora caninum (inaktiviert)
  • Probenverdünnungspuffer, PVP (eine Flasche mit 50 ml), konserviert mit Natriumazid, gebrauchsfertig
  • Waschpufferkonzentrat, WP (eine Flasche mit 50 ml), 10-fach konzentriert, konserviert mit ProClin 300
  • Positives Kontrollserum PK (eine Flasche mit 1,5 ml), Mischserum von N. caninum infizierten Rindern, konserviert mit Natriumazid, gebrauchsfertig
  • Negatives Kontrollserum NK (eine Flasche mit 1,5 ml), Mischserum von Rindern, konserviert mit Natriumazid, gebrauchsfertig
  • Konjugatlösung (eine Flasche mit 12 ml), konserviert mit ProClin 300, gebrauchsfertig
  • Substratlösung (eine Flasche mit 12 ml), Tetramethylbenzidin (TMB)-Lösung, konserviert mit Kathon, gebrauchsfertig
  • Stopplösung (eine Flasche mit 12 ml), 1 N Schwefelsäure, gebrauchsfertig Vorsicht ätzend !

ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE GERÄTE UND MATERIALIEN

Nicht im Lieferumfang enthalten: Behälter für Waschpuffer, destilliertes Wasser, Präzisionspipetten, Einwegpipettenspitzen, Pipettierwannen, Photometer für Mikrotiterplatten mit 450 nm Filter


ART DER ANWENDUNG

1. Verwendung der Mikrotiterplatten

Mit einer Mikrotiterplatte können maximal 93 Proben untersucht werden.
Die Mikrotiterplatte wird in einem Folienbeutel mit Wiederverschluss geliefert. In der Verpackung befindet sich außerdem ein Trockenbeutel mit Indikator.

Die Mikrotiterplatte besteht aus 12 Streifen mit je 8 einzeln abbrechbaren Reaktionsvertiefungen. Es sollten nur so viele Vertiefungen entnommen und auf Raumtemperatur (18 bis 25°C) gebracht werden, wie für die Untersuchung der entsprechenden Anzahl der Proben notwendig sind.

Es ist unbedingt darauf zu achten, dass der Folienbeutel nach jedem Öffnen wieder ordnungsgemäß verschlossen wird. Ein Farbumschlag des Trockenbeutel-Inhalts von blau nach rot deutet auf eine hohe relative Luftfeuchte im Folienbeutel hin. Die Funktionalität des Verschlusses sollte überprüft und der Trockenbeutel erneuert werden.

 

2. Vorbereitung der Testreagenzien

Die benötigten Testreagenzien sind vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur (18 bis 25°C) zu bringen.

Aus dem Behältnis mit der Konjugatlösung entnehmen Sie nur die benötigte Menge der Konjugatlösung und bringen diese auf Raumtemperatur. Nicht benötigte Konjugatlösung soll ständig bei 4 bis 7°C lagern und darf keinen Temperaturschwankungen ausgesetzt werden.

Verdünnen Sie die benötigte Menge Waschpufferkonzentrat (WPK) 1:10 mit destilliertem Wasser (1 Teil WP + 9 Teile Wasser, planen Sie pro Reaktionsvertiefung 4 ml Waschpuffer ein; z.B. 5 Proben + 2 Kontrollen + 1 Leerwert = 8 Vertiefungen x 4 ml Waschpuffer = 32 ml; ? 3,2 ml WP + 28,8 ml Wasser).

 

3. Probenvorbereitung

Es kann frisches, über wenige Tage kühl aufbewahrtes oder gefroren gelagertes Blutserum oder Blutplasma verwendet werden. Eingefrorene Proben sollten bei 37 °C oder bei Raumtemperatur rasch auftauen, niemals im Kühlschrank (!) -z. B. über Nacht - und sind in jedem Falle (auch frische oder kühl aufbewahrte Proben) vor der Verwendung gründlich zu durchmischen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren ggf. mit vorübergehender Lagerung im Kühlschrank (z. B. bei wiederholter Verwendung von Referenzproben) kann zur Erhöhung der Testergebnisse, insbesondere zu schwach falschpositiven Ergebnissen führen.

Verdünnen Sie die zu untersuchenden Proben 1:100 mit Probenverdünnungspuffer (495 µl PVP + 5 µl Serum / Plasma). Mischen Sie die Verdünnung gründlich.

 

4. Durchführung des Tests

  • Sämtliche Reagenzien sollen bei Anwendung auf Raumtemperatur (18 bis 25°C) gebracht sein.
  • Geben Sie je 100 µl des positiven und negativen Kontrollserums in die dafür vorgesehenen Vertiefungen (Einzelbestimmung).
  • Als Leerwert geben Sie 100 µl Probenverdünnungspuffer in die dafür vorgesehenen Vertiefung.
  • Geben Sie 100 µl der vorverdünnten Serumproben in die dafür vorgesehenen Vertiefungen (Einzelbestimmung).
  • Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie anschließend 60 min bei Raumtemperatur (18 bis 25°C).
  • Entleeren Sie danach die Vertiefungen und spülen Sie diese 5 mal mit jeweils 300 µl vorverdünntem Waschpuffer. Entfernen Sie die Restflüssigkeit gründlich (Vertiefungen im Rahmen kräftig aber mit der nötigen Vorsicht auf Zellstoff ausschlagen).
  • Geben Sie in jede Vertiefung 100 µl Konjugatlösung. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie anschließend 60 min bei Raumtemperatur (18 bis 25°C).
  • Entleeren Sie danach die Vertiefungen und spülen Sie diese 5 mal mit jeweils 300 µl vorverdünntem Waschpuffer. Entfernen Sie die Restflüssigkeit gründlich. (Vertiefungen im Rahmen kräftig aber mit der nötigen Vorsicht auf Zellstoff ausschlagen).
  • Geben Sie in jede Vertiefung 100 µl Substratlösung. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie anschließend 15 min bei Raumtemperatur (18 bis 25°C). Beginnen Sie mit der Zeitmessung nach Füllen der ersten Vertiefung. Wichtig! Entnehmen Sie vor dem Pipettieren die benötigte Menge Substratlösung und bringen Sie diese auf Raumtemperatur, wobei Sie niemals direkt aus der Flasche pipettieren sollten.
  • Geben Sie 100 µl Stopplösung in jede Vertiefung, und zwar in der selben Reihenfolge, in der Sie die Substratlösung zugegeben hatten.
  • Schütteln Sie gründlich. Messen Sie die Extinktionswerte (OD) innerhalb von 10 min nach Zugabe der Stopplösung mit einem Photometer bei 450 nm.

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE

1. Richtwerte zur Überprüfung der korrekten Testdurchführung

  • Notieren Sie die optischen Dichten der Kontrollseren PK und NK (ODPK, ODNK).
  • Berechnen Sie den Prozentsatz (P) der optischen Dichte des negativen Kontrollserums NK nach folgender Formel: P = (ODNK x 100) / (ODPK)
  • Die Testdurchführung war korrekt, wenn folgende Richtwerte erreicht wurden:

Positives Kontrollserum PK: ODPK > 0,8 < 2,8

Negatives Kontrollserum NK: P < 30

Leerwert (Probenverdünnungspuffer): OD < 0,3

 

2. Berechnung der Testergebnisse

  • Ziehen Sie von der optischen Dichte des positiven Kontrollserums und von der optischen Dichte der Proben (ODProbe) die optische Dichte des negativen Kontrollserums ab.

ODPK, korr = ODPK – ODNK

ODProbe, korr = ODProbe – ODNK

  • Berechnen Sie den Prozentsatz der optischen Dichte der Proben (Testergebnis, TE) nach folgender Formel:

TE = (ODProbe, korr x 100) / (ODPK, korr)

 

3. Bewertung der Testergebnisse

TE < 13 = negativ
TE 13 - 17 = fraglich
TE > 17 = positiv


VORSICHTSMAßNAHMEN UND WARNHINWEISE

Lagern Sie sämtliche Testkitbestandteile bei 4 bis 7 °C. Bringen Sie die benötigten Reagenzien vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18 bis 25 °C).

Setzen Sie die TMB Substratlösung nicht starkem Licht aus. Die Bestandteile des Testkits dürfen nicht verunreinigt und nicht mit Bestandteilen aus anderen Chargen vermischt werden.

Benutzen Sie die Bestandteile des Testkits nicht nach Ablauf des Verfalldatums. Den Test sollten nur Personen mit Kenntnissen in der Labortätigkeit ausführen. Die für ELISA-Tests übliche Umsichtigkeit wie Verwendung sorgfältig gereinigter Gefäße, sorgfältiges Pipettieren während der Testdurchführung sowie die Einhaltung konstanter Zeiten bei den Inkubationen und der Farbreaktion sind notwendig, um die Genauigkeit der Testergebnisse zu gewährleisten.

Einige Bestandteile des Testkits enthalten gefährliche Stoffe (Natriumazid, Kathon, ProClin 300). Bei der Beseitigung der Abfälle sind die jeweils gültigen gesetzlichen Bestimmungen einzuhalten.



Nur für den tierärztlichen Gebrauch.